蘇木素-伊紅（hematoxylin/eosin）染色法是一種用普通光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的簡便方法。細(xì)胞凋亡時(shí)主要的形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)高度凝集、邊緣化，呈新月狀，隨后染色質(zhì)裂解成大小不等的塊狀，核膜裂解，細(xì)胞以類似胞吐的方式形成凋亡小體。蘇木素容易被氧化，其氧化產(chǎn)物蘇木紅是真正的染料，蘇木紅與鋁結(jié)合形成一種帶正電荷的藍(lán)色色精，呈堿性。帶負(fù)電荷的脫氧核糖核酸根和帶正電荷的藍(lán)色色精進(jìn)行極性吸附而完成細(xì)胞核的染色。伊紅可分為幾種，如伊紅Y和伊紅B等。伊紅Y是一種酸性紅色胞質(zhì)性染料，對細(xì)胞質(zhì)、肌纖維及膠原纖維具有著色性，呈粉紅色。細(xì)胞經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色，根據(jù)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征可觀察細(xì)胞凋亡的情況。


貼壁細(xì)胞的H/E染色

1）對于貼壁生長的細(xì)胞，讓其在蓋玻片上爬行生長。

2）經(jīng)藥物或其他因素處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，取出蓋玻片，用×1 PBS輕輕洗滌，室溫，3分鐘×3次。

3）用4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘，取出細(xì)胞爬片，室溫晾干，-20℃保存或直接進(jìn)行染色。

4）蒸餾水浸泡細(xì)胞爬片5分鐘。

5）放入蘇木精液染5~7分鐘。

6）流水洗去附著染液，1%鹽酸酒精分化1~2秒。

7）流水沖洗10分鐘藍(lán)化，使切片由淡紅色變?yōu)榛宜{(lán)色。

8）放入伊紅染液中2~5秒。

9）放入95%酒精Ⅰ（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（5分鐘）→二甲苯Ⅰ（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）中脫水、透明。

10）中性樹膠封片。

11）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。


懸浮細(xì)胞的H/E染色

1）對于懸浮生長的細(xì)胞經(jīng)藥物或其他因素處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，置入離心管中，離心（1000rpm，5分鐘），收集細(xì)胞。

2）×1 PBS洗滌細(xì)胞1~2次。

3）調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（1~15）×104/ml，涂片或用離心甩片，4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘，取出細(xì)胞爬片，室溫晾干，-20℃保存或直接進(jìn)行染色。

4）蒸餾水浸泡細(xì)胞爬片5分鐘。

5）接貼壁細(xì)胞H/E染色步驟中的5）-11）。


注意事項(xiàng)

①細(xì)胞核染色淡，原因可能為蘇木素染色時(shí)間過短、染液過度氧化失去染色能力或者分化步驟時(shí)間過長等；而細(xì)胞核染色過深的原因可能為蘇木素染色時(shí)間過長或者分化時(shí)間太短。

②細(xì)胞核如果呈紅或棕色，原因可能為蘇木素染液過度氧化或蘇木素染色后水中返藍(lán)不足，可用流水或弱堿性溶液如稀氨水或0.2%NaHCO3，在蘇木精染色后給細(xì)胞足夠的藍(lán)化時(shí)間。

③當(dāng)室溫低，不利于染色時(shí)，通?？捎眉訜崛疽旱姆椒ㄟM(jìn)行染色。